Giriş: Konjenital hemolitik anemiler (KHA), klinik ve genetik heterojeniteye sahip nadir hastalıklardır. Eritrositlerdeki membran defektleri, eritrosit enzim kusurları veya inefektif eritropoez KHA oluşum nedenlerindendir. Son yıllarda rutin uygulamada yer bulan genişletilmiş tanı panellerine rağmen çözümlenememiş olgularda tüm ekzom dizileme ile kongenital hemolitik anemi gibi nadir hastalıklarda tanıya ulaşmak ve hastalıkla ilgili yeni genlerin ortaya çıkartılması mümkün olmaktadır. Bu çalışmada, konvansiyonel tanı yaklaşımları ile klinik sınıflandırılması yapılamamış 12 anemi olgusunda, tüm ekzom dizileme (TED) ile genotip-fenotip ilişkisinin kurulması amaçlanmıştır.

Materyal ve Yöntem: Pediatrik hematoloji kliniğinde hemolitik anemi tanısı ile takip edilen (n=36) hasta rutin genetik tanı testleri, aile öyküsü ve klinik açıdan ön değerlendirilmeye alınmıştır. Rutin hemolitik anemi laboratuvar ve genetik tanı testleri ile moleküler tanısı konulamayan, yazılı onam formları alınmış 12 aile (indeks olgu ve diğer aile bireyleri) çalışmaya dahil edilmiştir. Periferik kandan izole edilen DNA örneklerinde, indeks olgular tüm ekzom dizileme yöntemi ile çalışılmıştır. Ham ekzom verisi, BWA ve SAMtools ile hg38 referans genomuna hizalanmıştır. Filtreleme yanlış anlamlı (missense), çerçeve kayması (frameshift) ve kırpılma (splice) varyasyonları ve minör allel frekansına (MAF<0.005) göre yapılmıştır. Populasyon verisi için 1000Genomes, ExAC, gnomAD veritabanları ve varyasyonların olası patojenik etkisini beliryebilmek için in silico tahmin araçları (Polyphen2, Provean, Mut.Taster, SIFT, CADD) kullanılmıştır. Klinik değerlendirme için OMIM, ClinVar ve PubMed veritabanlarından yararlanılmıştır. Analiz sonucu belirlenen aday genlerin doğrulaması Sanger dizileme ile ailesel segregasyon analizlerinin yapılması yoluyla gerçekleştirilmiştir.

Bulgular: Hastaların yaş dağılımı 29-211 ay (ort. 107ay ±68) arasında, izlem süresi ise 27-174 ay (ort. 78ay ±56) idi.  Çalışmaya dahil edilen hastaların kız/erkek oranı %50 idi. Başvuru sırasındaki hemoglobin düzeyi 4-9 gr/dL (ort.6,95 ±1,64) olarak saptandı. On bir hastada düzenli transfüzyon ihtiyacı vardı. İki hastada splenektomi ve bir hastada kolsistektomi yapılmıştı. Ailelerde akraba evliliği (n=6) ve hemolitik anemi bulgularını düşündüren aile öyküsü (n=8) mevcuttu. Panellerde varyasyon tespit edilmeyen ve çalışmamız kapsamında tüm ekzom dizileme yapılan olguların %58’sinde (n=7) hemolitik anemi ile ilişkilendirilmiş ve fenotiple uyumlu olabilecek varyasyonlar belirlenmiştir. Dört ailede (SPTA1 heterozigot c.466C>T, p.Arg156Trp ve EPB41 heterozigot c.640G>A, p.Val214Ile, SPTB heterozigot c.5051G>A, p.Arg1684His, PIEZO1 heterozigot c.7367G>A, p.Arg2456His) kalıtsal membran hasarı, bir ailede (PKLR homozigot c.1516G>A, p.Val506Ile) kalıtsal enzim eksikliği, bir ailede (CDIN1 birleşik heterozigot p.Arg101Trp ve p.Pro248fs) inefektif eritropoez hasarı, bir ailede de (ALAS2 heterozigot, c.1435C>T, p.Arg479Trp) sideroblastik anemi ile ilişkili varyasyon tespit edilmiştir. Varyasyon saptanan ailelerde anne-baba-varsa etkilenmiş kardeşlerde segregasyon analizleri ile doğrulama yapılmıştır. Üç ailede hastalıkla ilişkili yeni aday gen belirlenmiştir, fonksiyonel çalışmalar planlanmaktadır. Diğer olgularda enformatik analizler devam etmektedir.

Tartışma: Bu çalışma, konvansiyonel tanı testleri ve klinik değerlendirme ile hemolitik anemi sınıflandırılması yapılamamış olgularda tüm ekzom dizilmemenin sağladığı avantajları ortaya koymaktadır. Çözümlenmemiş hemolitik anemi olgularda gerçekleştirilen tüm ekzom analizleri ile tanı başarısı bilinen kalıtsal anemi genler için ancak %60’lara çıkmaktadır. Öte yandan tüm ekzom analizleri hastalıkla ilişkili yeni aday gen/varyantların bulunmasında son derece kıymetlidir ki bu çalışma kapsamında klinik fenotipleri destekleyen en az 3 yeni aday gen saptanmıştır. Tüm ekzom analizlerinin çözümsüz kaldığı olgularda tüm genom dizileme ve/veya metilom araştırmaları yapılmalıdır.