Akademik Veri Yönetim Sistemi
VIII. Uluslararası Katılımlı Lizozomal Hastalıklar Kongresi, Bursa, Türkiye, 3 - 07 Mayıs 2023, ss.64
Giriş ve Amaç: Nöronal seroid lipofuksinozis (NCL) ailesine ait CLN2 hastalığı ultra nadir
otozomal resesif nörodejeneratif bir bozukluktur. Tripeptidil peptidaz-1 (TPP1) enzim
eksikliğine bağlı gelişen CLN2 tanısında önerilen altın standart testler, TPP1 enzim aktivite
eksikliğinin lökositlerde veya kuru kan örneğinde (DBS) gösterilmesi ve TPP1’deki
patojenik varyantların tanımlanmasıdır. Erken tanı, tedaviye erken başlanmasına ve aileye
zamanında genetik danışma verilmesini sağlar. Bu çalışmada, lökosit ve kuru kan
örneklerinde (DBS) florometrik yöntemle TTP1 enzim analizinin validasyonu
amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntem: Testin analitik performansı, CLIA 88 (Clinical Laboratory Improvement
Amendments) kriterlerine göre planlanlanmış; veri değerlendirmesi CLSI (The Clinical &
Laboratory Standards Institute) C24-A3 kılavuzuna göre yapılmıştır. Pozitif kontrol
örnekleri, düşük TTP1 aktivitesine sahip, CLN2 tanısıyla uyumlu klinik bulguları ve
moleküler tanısı olan sekiz indeks olgudur. Aile bireyleri ve indeks olgulardan oluşan 23
örneğin yanında, yaş-cinsiyet uyumlu 8 negatif kontrol DBS ve lökosit örneği çalışmaya
dahil edilmiştir. TPP-1 enzim aktivitesi florometrik yöntemle ölçülmüştür. EDTA’lı tüpe
alınan kan örneklerinden lökosit izolasyonu yapılmıştır. Bradford yöntemiyle protein
miktarı, Beta-galaktosidaz enzim tayiniyle örnek kalitesi belirlenmiştir. Standart olarak 4-
methylcoumarin, substrat olarak Ala-Ala-Phe 7-amido-4-Methylcoumarin, tampon olarak
pH 4.0’de asetik asit-asetat çözeltisi kullanılmıştır. DBS’den, 3.2 mm çapında diskler
alınarak, tümüne 40 μL substrat ve 20 μL %0.85 NaCl eklenerek 37°C 20 saat inkübe
edilmiştir. Sonuçlar nmol/saat/ml olarak hesaplanmıştır. Lökosit örneklerinden 1.5 mg/ml
protein içeren homojenatlar kullanılmıştır. Örneklere 20 μL substrat ve 40 μL % 0.425 NaCleklenerek 37°C 2 saat inkübe edilmiş ve sonuçlar nmol/saat/mg protein olarak
hesaplanmıştır.
Bulgular: Pozitif ve negatif kontrollerde lökosit ve DBS için TPP1 aktiviteleri sırasıyla,
9.6±3.07 ve 30.2±9.21 nmol/h/mg protein, 2.17±0.74 ve 8.83±2.05 nmol/h/mg protein
olarak belirlenmiştir. Yöntemin kesinliği, pozitif ve negatif numune alikotları ve havuz
dilüsyonlarından, aynı uygulayıcı tarafından, aynı gün 3 kez ve 10 farklı günde çift olarak
hazırlanarak analiz edilmiştir. Gün içi ve günler arası varyasyon katsayısı sırasıyla, %10 ve
%12’nin altında ve kabul edilebilir sınırlarda bulunmuştur.
Tartışma ve Sonuç: CLN2 gibi tedavisi olan nadir hastalıklarda, enzim analizlerinin valide
edilerek uygulanması doğru tanı verilebilmesi noktasında gerekli olup, klinik stratejilerin
yönetimi ve hastaların erken tadaviye ulaşımı açısından yüksek öneme haizdir.
Introduction and Purpose: CLN2 disease, belonging to the neuronal ceroid lipofuscinosis (NCL) family, is an ultra-rare disease.
It is an autosomal recessive neurodegenerative disorder. Tripeptidyl peptidase-1 (TPP1) enzyme
The gold standard tests recommended for the diagnosis of CLN2, which develops due to deficiency, are TPP1 enzyme activity
deficiency is demonstrated in leukocytes or dried blood sample (DBS) and TPP1
is the identification of pathogenic variants. Early diagnosis leads to early initiation of treatment and family
Ensures timely genetic counseling. In this study, leukocyte and dry blood
Validation of TTP1 enzyme analysis by fluorometric method in samples (DBS)
is intended.
Materials and Methods: Analytical performance of the test, CLIA 88 (Clinical Laboratory Improvement
Planned according to (Amendments) criteria; data evaluation CLSI (The Clinical &
Laboratory Standards Institute) C24-A3 guide. positive control
samples, with low TTP1 activity, clinical findings consistent with a CLN2 diagnosis, and
There are eight index cases with molecular diagnosis. 23 patients consisting of family members and index cases
In addition to the sample, 8 age-gender matched negative control DBS and leukocyte samples were included in the study.
has been included. TPP-1 enzyme activity was measured by fluorometric method. EDTA tube
Leukocyte isolation was performed from the blood samples taken. Protein by Bradford method
The quantity and sample quality were determined by Beta-galactosidase enzyme determination. As standard 4-
methylcoumarin as substrate Ala-Ala-Phe 7-amido-4-Methylcoumarin as buffer
Acetic acid-acetate solution at pH 4.0 was used. Discs from DBS, 3.2 mm diameter
40 μL of substrate and 20 μL of 0.85% NaCl were added and incubated at 37°C for 20 hours.
has been made. Results are calculated as nmol/hour/ml. 1.5 mg/ml from leukocyte samples
Protein-containing homogenates were used. 20 μL of substrate and 40 μL of 0.425% NaCl were added to the samples and incubated at 37°C for 2 hours, and the results were expressed as nmol/hour/mg protein.
has been calculated.
Results: TPP1 activities for leukocyte and DBS in positive and negative controls, respectively,
9.6±3.07 and 30.2±9.21 nmol/h/mg protein, 2.17±0.74 and 8.83±2.05 nmol/h/mg protein
was determined as . Precision of the method, positive and negative sample aliquots and pool
dilutions, by the same practitioner, 3 times on the same day and in duplicate on 10 different days.
was prepared and analyzed. Intraday and interday coefficients of variation were 10% and 10%, respectively.
It was found to be below 12% and within acceptable limits.
Discussion and Conclusion: In rare diseases with treatment such as CLN2, enzyme analyzes should not be validated.
It is necessary to make a correct diagnosis and to implement clinical strategies.
It is of great importance in terms of management and access of patients to early treatment.